ROS流式分析
一、服務(wù)簡介：
目前檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平常用的是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA可以自由穿過細(xì)胞膜，本身沒有熒光。細(xì)胞內(nèi)的酯酶可將DCFH-DA水解生成不能通過細(xì)胞膜的DCFH，這樣使得探針在細(xì)胞內(nèi)形成積聚。經(jīng)過經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS的氧化，DCFH可轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾腄CF，且熒光的強(qiáng)度與ROS的水平成正比。
二、樣本要求及實驗流程：
- 準(zhǔn)備細(xì)胞：將目的細(xì)胞均勻鋪至六孔板中，實驗組和對照組分別做相應(yīng)處理，并預(yù)設(shè)空白管（即不裝載探針）。至細(xì)胞密度達(dá)到80%-95%。
- 清洗：用PBS將六孔板中細(xì)胞分別清洗1-2次，并棄去PBS。
- 消化：用胰酶將六孔板中細(xì)胞消下來，移至1.5mlEP管中，并做好標(biāo)記。
- 離心：1200r，常溫，離心5min。
- 探針配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml無血清培養(yǎng)基配制，上下顛倒混勻（注意避光）。
- 加入探針：棄去4中培養(yǎng)基，空白管加入1ml無血清培養(yǎng)基，其余均加入1ml配制好的探針液，并重懸細(xì)胞（注意避光）。
- 孵育：37°C避光孵育20min。
- 離心：1200r，常溫，離心5min，棄去上清。
- 清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常溫，離心5min，棄去上清，重復(fù)2次（注意避光）。
- 上機(jī)：將細(xì)胞用500μl冷PBS重懸，并移至流式管，上機(jī)。
- 注意事項：
- 1、消化細(xì)胞時，以細(xì)胞剛好掉落為好，不可時間過長，避免過度消化造成細(xì)胞損傷而影響實驗結(jié)果。
- 2、探針配置時，一般按照1：1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA（終濃度為10Μm），不同的細(xì)胞系條件有所不同，需自行摸索。
- 3、加入探針后，一定要充分混懸細(xì)胞，以保證探針完全結(jié)合。
- 4、探針孵育時，每隔3-5min需顛倒混勻。
- 5、探針孵育時間不同細(xì)胞可能會不一樣，一般為20-30min。
- 6、最佳激發(fā)波長為488nm，最佳發(fā)射波長為525nm。
