詳細(xì)介紹下原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟

　　細(xì)胞通常在-196°C的溫度下存儲(chǔ)在液氮中，理論上具有無(wú)限的存儲(chǔ)時(shí)間。細(xì)胞冷凍和復(fù)蘇的基本原理是緩慢冷凍和快速解凍。實(shí)驗(yàn)表明，這可以顯著維持細(xì)胞活力。細(xì)胞恢復(fù)是將原本冷凍保存(凍結(jié))的細(xì)胞恢復(fù)為正常增殖狀態(tài)的過(guò)程，今天我們來(lái)看看原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟。

　　一、檢查

　　收到細(xì)胞系包裝時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞系冷凍管是否已解凍。 如果已解壓縮，請(qǐng)立即處理并告知發(fā)件人。盡快開(kāi)始培養(yǎng)細(xì)胞系或立即冷凍(在–70°C下儲(chǔ)存過(guò)夜并轉(zhuǎn)移到溶液N2中)。

　　二、冷凍細(xì)胞解凍

　　1.根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型，血清類型以及細(xì)胞系聲明中指定的其他指定成分和比率，準(zhǔn)備培養(yǎng)基。

　　大多數(shù)細(xì)胞不能輕易適應(yīng)不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同類型的血清。如果由于實(shí)驗(yàn)的需要而有所不同，請(qǐng)緩慢而逐漸地改變培養(yǎng)基的成分。細(xì)胞適應(yīng)并進(jìn)行必要的實(shí)驗(yàn)。

　　2. FBS(胎牛血清)，CS(小牛血清，小牛血清)，HS(馬血清，馬血清)因細(xì)胞而異。確保根據(jù)細(xì)胞系信息中列出的血清類型培養(yǎng)細(xì)胞。

　　3.將培養(yǎng)基放入37°C的水箱中加熱，用70%的酒精噴灑，加熱后擦去，然后將其轉(zhuǎn)移到無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上。取下冷凍管，立即將其放入37°C的水箱中以快速融化。水位不應(yīng)接近或高于冷凍管的蓋子。否則，很可能發(fā)生污染。輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)完全溶解，用70%的乙醇擦拭冷凍管的外部，然后移至無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上。

　　4.根據(jù)細(xì)胞類型和濃度，在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上的T25或T75燒瓶中加入10 ml培養(yǎng)基。取出融化的細(xì)胞懸液，緩慢地將培養(yǎng)基添加到T25或T75燒瓶中，充分混合，然后在5%CO2孵育箱中于37°C孵育。

　　5.在大多數(shù)細(xì)胞中，少于1%的防凍DMSO不會(huì)對(duì)細(xì)胞附著或激活產(chǎn)生不利影響。不需要立即將其從解凍的細(xì)胞中取出。第二天確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)或附著。卸下后將其牢固安裝。

　　對(duì)于非常少數(shù)對(duì)DMSO敏感或引起細(xì)胞分化的細(xì)胞，如果需要立即去除DMSO，請(qǐng)將解凍的細(xì)胞懸液置于5-10 ml培養(yǎng)基和300 xg(約)中，以1000 rpm離心5分鐘，然后小心取出。向上清液中添加適量的新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，并在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C孵育。

　　3.如何處理T25燒瓶細(xì)胞

　　1.在運(yùn)輸過(guò)程中，用培養(yǎng)基填充所有T25燒瓶，以防止起泡，細(xì)胞脫落和死亡。檢查燒瓶的外觀，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和污染。如果有問(wèn)題，請(qǐng)勿打開(kāi)蓋子。請(qǐng)立即與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系。

　　2.將原始的T25燒瓶放入37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞加熱至37°C，然后重新附著并增殖在運(yùn)輸過(guò)程中脫落的少量細(xì)胞。

　　第二天，將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物移至無(wú)菌技術(shù)箱中(去除的培養(yǎng)基可重復(fù)使用)，留出約5-10 ml進(jìn)行基于培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)，然后根據(jù)常規(guī)方法將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中。或者，如果細(xì)胞穿過(guò)板，則將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

　　四，細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

　　1.在整個(gè)恢復(fù)過(guò)程中更加靈活。如果前面太長(zhǎng)，可能會(huì)影響愈合效果。

　　2.使用鑷子，因?yàn)椤俺边^(guò)程中冷凍管與水之間的溫差太大，尤其是液氮冷凍保存管，浸入水中會(huì)影響視力。冷凍管。將沉淀管推入水中，以便即使破裂也可以作為緩沖液存在。

　　3.小心凍傷，尤其是在夏天卸下冷凍管時(shí)。盡管有熱量，還是需要穿上長(zhǎng)袖的實(shí)驗(yàn)室外套。疏忽大意的運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致一小塊新鮮的肉“粘”在冰箱門(mén)上。

　　4.離心步驟也可以在冷凍管中的冰融化后立即進(jìn)行。也就是說(shuō)，將冷凍管直接離心，離心后將原來(lái)的冷凍保存液丟棄，然后直接添加完全培養(yǎng)基以重懸細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿/燒瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。此方法可能無(wú)法干凈地除去DMSO，但效果不大。

　　5.不要忘記在恢復(fù)的第二天檢查細(xì)胞。如果條件良好，則恢復(fù)成功。