基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建流程

　　生物學(xué)家總是在基因敲除細(xì)胞之前進(jìn)行基因敲除，但由于shRNA本身的技術(shù)限制，無法獲得基因功能完全缺失的體細(xì)胞，shRNA敲除的情況頻頻發(fā)生，但體細(xì)胞WB的實(shí)際效果并不是很明顯好的。另外Knockout應(yīng)用移碼敲除的方法也會(huì)出現(xiàn)WB敲除不干凈的難題!所以，畢竟我們選擇創(chuàng)造基因敲除細(xì)胞(大面積敲除)來徹底敲除基因基因的蛋白質(zhì)功能。怎樣才可以效率高的做體細(xì)胞遺傳基因大面積段敲除呢?原代細(xì)胞公司的小編下面就來說明一下：

　　基因敲除細(xì)胞系的步驟以下：

　　1.選擇敲除基因位點(diǎn)和Cas9X敲除載體構(gòu)建：(2周)

　　通常，您選擇 1-10 kb 的片段大小進(jìn)行敲除。這個(gè)大小適合效率。選擇非三倍率外顯子進(jìn)行敲除通常更有效。如果你對它滿意，你能夠挑選大的精彩片段做就可以了;

　　然后，您可以設(shè)計(jì)生成 Dual-gRNA 的計(jì)劃，根據(jù) PCR 將目標(biāo) gRNA 整合到敲除培養(yǎng)基中，并在轉(zhuǎn)錄組測序后將其用于事后實(shí)驗(yàn)。

　　2、體細(xì)胞的提前準(zhǔn)備與轉(zhuǎn)染：(2周)

　　Cas9X一般應(yīng)用電轉(zhuǎn)的方法搭建體細(xì)胞敲除細(xì)胞株：一般搭建敲除細(xì)胞株能夠 應(yīng)用電轉(zhuǎn)或是病毒感染或是脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法;

　　A、脂質(zhì)體的參照每個(gè)企業(yè)的使用說明;

　　B、假如應(yīng)用電轉(zhuǎn)的效率會(huì)高1倍上下;

　　C、應(yīng)用Cas9X特有的VIRUS-Free技術(shù)性的高效率與應(yīng)用病毒感染的實(shí)際效果基礎(chǔ)非常(可是周期時(shí)間減少一半);

　　電轉(zhuǎn)后歷經(jīng)三天的藥物篩選，隨后就可以做單克隆了。

　　基因敲除細(xì)胞系全過程中單克隆的方式有三種，這三種方式原代細(xì)胞公司的小編下一次會(huì)給與表明解讀。