原代細胞的分離方法都有哪些

　　人體或動物體(或胚胎組織)與各種細胞緊密結合，在體外不會導致單個細胞的生長和再生。現有的組織塊需要完全分散以分離細胞。

　　1. 分離漂浮細胞的方法

　　如果組織材料來自血液、羊水、胸腔積液或腹水的懸浮液，簡單的方法是進行 1000 r/min 緩慢離心 10 分鐘。離心后，不同密度的不同細胞在分層溶液中形成不同的層，允許根據需要收獲感興趣的細胞。

　　2、實體組織材料的分離方法

　　在固體組織材料的情況下，細胞是緊密結合的，所以采用機械分散(物理裂解)和消化分離的方法，使組織內的細胞完全分散，形成細胞懸液，可以使用。

　?、?機械分散法

　　特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。

　?、?消化分離法

　　組織消化將組織分成更小的團塊(或糊狀物)，并利用酶的生化和非酶促化學作用，進一步松開細胞間的橋梁結構，使團塊變大并結塊。此時，可采用機械方法通過移液或電磁攪拌或在搖瓶中振動的方式分散細胞團，分散少量細胞團和大量單細胞。細胞懸液可制成細胞，接種培養(yǎng)后，細胞更容易貼壁。

　　Ⅰ 酶消化分離法

　　酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

　　胰蛋白酶是胰腺的產物，對蛋白質具有水介導作用，主要作用于與賴氨酸和精氨酸結合的肽鍵，介導細胞間質中的蛋白質與水和分散細胞。

　　膠原酶是從細菌中提取的一種酶，對膠原蛋白有很強的消化作用。適用于纖維組織、上皮組織、癌組織的消化，對細胞間質的消化效果非常好。

　　除了上面列出的兩種常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白、蝸牛酶、彈性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

　?、?非酶消化法(EDTA消化法)

　　EDTA 是一種非酶消化物，也稱為螯合劑或 Versene，其正式名稱為乙二胺四乙酸。常用無鈣鎂離子的PBS配制0.02%工作液。這對一些組織，尤其是上皮組織有很好的分散作用。 這種化學物質可以與細胞上的鈣和鎂離子結合形成螯合物。機械力環(huán)繞細胞并分散它們，或從瓶壁去除貼壁細胞。

　?、?消化分離法的操作步驟

　　剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散

　　Ⅳ 消化分離法的注意事項

　　組織塊應沖洗2-3次，以去除鈣、鎂離子和血清對組織中胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

　　胰蛋白酶濃度不宜過高，作用時間不宜過長，以免產生毒性作用。

　　消化后，不僅要盡量將消化液倒掉以免中毒，而且動作要輕，以免因沖洗造成大塊細胞流失。