熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)操作

　　Annexin V是鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，其對(duì)磷脂酰絲氨酸PS具有高親和力。在細(xì)胞凋亡的早期，它通過細(xì)胞外暴露的PS與細(xì)胞膜結(jié)合，并使用流式細(xì)胞儀用熒光染料標(biāo)記AnnexinV。熒光顯微鏡可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡。由于緩慢的凋亡或壞死細(xì)胞膜完整性的喪失，核染色劑可進(jìn)入細(xì)胞并染色核。 當(dāng)與膜聯(lián)蛋白A結(jié)合使用時(shí)，它可以區(qū)分處于凋亡不同階段的細(xì)胞。

　　1.懸浮細(xì)胞：

　　A.根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以300 g離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，用PBS洗滌一次，然后輕輕重懸并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

　　B.取1-5 x 105重懸細(xì)胞，以300 g離心5分鐘，棄去上清液。 通過添加500μL稀釋至1×的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。

　　C.向細(xì)胞懸液中加入5μL熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和5μL核染色劑。

　　D.輕輕渦旋并混合，然后在室溫下于黑暗中孵育15-20分鐘。

　　E.反應(yīng)完成后，將立即對(duì)機(jī)器進(jìn)行測(cè)試。如果測(cè)試不及時(shí)，請(qǐng)將其放在冰上，避免光照，以在1小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試。

　　F.檢測(cè)

　　1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)

　　處理好的樣本在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

　　2) 熒光顯微鏡分析

　　取一滴用熒光素-Annexin V/細(xì)胞核染色液雙染的細(xì)胞懸液(E步驟處理過的細(xì)胞懸液)于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

　　2.貼壁細(xì)胞

　　1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)

　　A.根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，吸出培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管(備用)中，并用PBS洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。

　　B.將適量的胰蛋白酶消化的細(xì)胞添加到培養(yǎng)瓶中，并在室溫下孵育，直到通過輕輕移液將附著的細(xì)胞分離，并吸出胰蛋白酶消化的溶液，以避免胰蛋白酶過度消化。注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化步驟很重要。如果胰蛋白酶的消化時(shí)間太短，則需要吹走細(xì)胞并容易損壞細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性。如果消化時(shí)間過長(zhǎng)，很可能會(huì)發(fā)生。它會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，細(xì)胞壞死的假陽(yáng)性，并影響磷脂酰絲氨酸與細(xì)胞膜上膜聯(lián)蛋白V-熒光素的結(jié)合，從而干擾細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。同時(shí)，胰蛋白酶細(xì)胞消化應(yīng)不含EDTA，因?yàn)镋DTA會(huì)影響膜聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。

　　C.加入步驟A中收集的細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹動(dòng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管中，以300 g離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞一次，并輕輕懸浮細(xì)胞。注意：添加細(xì)胞培養(yǎng)基非常重要。另一方面，可以收集已經(jīng)發(fā)生凋亡或壞死的漂浮細(xì)胞。另一方面，細(xì)胞培養(yǎng)物中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶(消化殘余的胰酶，然后添加膜聯(lián)蛋白V-熒光素以降解和染色失敗)。

　　D.取1-5 x 10重懸細(xì)胞，以300 g離心5分鐘，棄去上清液。通過添加500μL稀釋至1×的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。

　　E.向細(xì)胞懸液中加入5μL熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和5μL核染色劑。

　　F.輕輕渦旋并混合，然后在黑暗中于室溫下孵育15-20分鐘。

　　G.反應(yīng)完成后立即在機(jī)器上進(jìn)行測(cè)試。如果測(cè)試不及時(shí)，請(qǐng)將其放在冰上，避免光照，以在1小時(shí)內(nèi)完成測(cè)試。

　　H.流式細(xì)胞儀檢測(cè)

　　2)熒光顯微鏡原位檢測(cè)注：本方法優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于貼壁不牢而檢測(cè)不到。

　　A.如果條件可以，在誘導(dǎo)凋亡后，用多孔板離心機(jī)300g離心5min。

　　B.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次(如果條件允許，在此前做步驟A)。

　　C.離心后棄上清，加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。

　　D. 加入5μL的熒光素標(biāo)記-Annexin V和5μL的細(xì)胞核染色液。

　　E.移液器輕輕混勻，室溫避光孵育15-20min。

　　F.Annexin V Binding Buffer工作液洗滌細(xì)胞一次

　　G. 熒光顯微鏡檢測(cè)。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。(如果無法觀察，可以在孔板下鋪上玻片使細(xì)胞貼附，然后取出用Annexin V Binding Buffer浸潤(rùn)觀察)

　　H. 反應(yīng)完成后應(yīng)立即觀察，取出貼附細(xì)胞玻片時(shí)，避免細(xì)胞干片。